Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (Fluorescence in situ Hybridization – FISH)
Tổng quan về kỹ thuật FISH
Việc sử dụng FISH đang phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực như hệ gen học (genomics), di truyền học tế bào (cytogenetics), nghiên cứu trước sinh (prenatal research), sinh học khối u (tumor biology), đánh dấu bằng bức xạ (radiation labels), lập bản đồ gen (gene mapping), khuếch đại gen (gene amplification) và nghiên cứu y sinh cơ bản. Về nguyên tắc, kỹ thuật này khá đơn giản.
Phản ứng lai (hybridization) cho phép xác định hoặc đánh dấu các trình tự mục tiêu trong hệ gen, nhờ đó có thể nghiên cứu vị trí và kích thước của chúng. Trước tiên, các đầu dò (probe) mang trình tự DNA hoặc RNA đặc hiệu cho từng nhiễm sắc thể sẽ được gắn các phân tử chỉ thị (reporter molecules), các phân tử này đã được gắn thuốc nhuộm huỳnh quang. Tiếp theo, probe DNA hoặc RNA sẽ được lai với các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa (metaphase chromosomes) hoặc các nhân tế bào ở kỳ trung gian (interphase nuclei) trên lam kính. Sau khi rửa và khuếch đại tín hiệu, mẫu sẽ được kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện các phân tử chỉ thị.
FISH cho phép xác định rất chính xác vị trí của các hình thái và cấu trúc trong hệ gen. Kỹ thuật này nhanh, dễ triển khai và có độ ổn định cao. Tùy thuộc vào loại probe được sử dụng, có thể xác định được toàn bộ hệ gen của một loài cụ thể, toàn bộ nhiễm sắc thể, các vùng đặc hiệu trên nhiễm sắc thể, hoặc các trình tự đặc hiệu chỉ có một bản sao.
Sự phát triển về phần cứng và phần mềm
Gần sáu thập kỷ đã trôi qua kể từ khi những bài báo nghiên cứu đầu tiên giới thiệu kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization) như một phương pháp để phát hiện và nghiên cứu các trình tự DNA trong nhiễm sắc thể và tế bào được công bố trong các tài liệu khoa học. Trong khoảng thời gian đó, một cuộc cách mạng về kính hiển vi quang học đã diễn ra thông qua sự phát triển của các kỹ thuật huỳnh quang, cho phép thực hiện việc định vị, nhận diện và ghi nhận dữ liệu về cấu tạo di truyền của các mẫu sinh học với mức độ dễ dàng, độ chính xác và độ chuẩn xác chưa từng có.
Hình 1: ví dụ về mẫu FISH đa màu điển hình. Các tế bào lympho của nam giới bình thường được lai với các đầu dò (probe) Chr21 và ChrY được đánh dấu bằng FITC-biotin, và các probe Chr13 và ChrY được đánh dấu bằng CY3-digoxigenin. (a) hình ảnh DNA trong nhân được nhuộm bằng DAPI, được chụp bằng một bộ lọc DAPI. (b) hình ảnh của Chr21 và ChrY được nhuộm bằng FITC, được chụp bằng một bộ lọc FITC. (c) hình ảnh của Chr13 và ChrY được nhuộm bằng CY3, được chụp bằng một bộ lọc CY3. (d) ảnh màu tổng hợp được ghép từ các kênh màu, cho thấy tất cả các nhiễm sắc thể mục tiêu bằng các màu tương ứng. Mẫu vật được cung cấp bởi Dr. Tim Houseal, Integrated Genetics, Framingham, Massachusetts.
Khả năng của lai tại chỗ (in situ hybridization) có thể được mở rộng đáng kể bằng cách sử dụng đồng thời nhiều kênh màu huỳnh quang. Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang đa kênh màu (multicolor fluorescence in situ hybridization – FISH) ở dạng đơn giản nhất có thể được sử dụng để xác định số lượng đặc điểm được đánh dấu tương ứng với số chất nhuộm huỳnh quang (fluorophore) khác nhau được sử dụng trong quá trình lai. Bằng cách sử dụng không chỉ các màu riêng lẻ mà còn cả các tổ hợp màu, nhiều đặc điểm được đánh dấu hơn có thể được phát hiện đồng thời trong từng tế bào bằng kính hiển vi kỹ thuật số.
Các kỹ thuật FISH đa màu, kết hợp với công nghệ chụp ảnh kỹ thuật số, ngày nay mang lại khả năng vượt trội trong việc phát hiện đồng thời nhiều trình tự acid nucleic mà không cần sử dụng đồng vị phóng xạ, phục vụ cho việc phân tích các thành phần của tế bào, nhiễm sắc thể và gen.
Huỳnh quang là một hiện tượng trong đó một chất hóa học, sau khi được kích thích bởi ánh sáng ở một bước sóng nhất định, sẽ phát ra ánh sáng ở một bước sóng khác, thường là dài hơn. Hiện tượng này được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực khoa học sự sống để nghiên cứu nhiều loại cấu trúc và các hoạt động diễn ra bên trong tế bào. Những tiến bộ trong công nghệ phát triển đầu dò (probe ) và kính hiển vi đã thúc đẩy sự phát triển nhanh chóng của các kỹ thuật huỳnh quang trong thập kỷ qua.
Bài tổng quan này sẽ trình bày những kiến thức cơ bản về kỹ thuật FISH, những hạn chế mà các nhà nghiên cứu đã gặp phải trong quá trình sử dụng FISH qua nhiều năm, cũng như những phát triển gần đây về phần cứng, phần mềm, probe và thuốc thử, những yếu tố đã góp phần thúc đẩy sự phát triển của kỹ thuật này. Ngoài ra, bài tổng quan sẽ đề cập đến những phát triển mới của FISH khi kỹ thuật này bắt đầu được mở rộng từ phạm vi nghiên cứu cơ bản sang các ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng.
Những bất lợi trước đây
Đối với trước đây, FISH vẫn bị hạn chế bởi phần cứng, phần mềm, thuốc thử, công nghệ probe và chi phí cần thiết để triển khai kỹ thuật này.
Các hệ thống kính hiển vi thương mại được tối ưu hóa cho FISH đa màu phải đến giữa những năm 1990 mới bắt đầu có mặt trên thị trường. Trước thời điểm đó, kính hiển vi phải được tùy chỉnh riêng để sử dụng cho các ứng dụng FISH. Hầu hết các hệ thống quang học của kính hiển vi khi đó không được thiết kế để phát hiện mức ánh sáng rất thấp, vốn là đặc trưng của tín hiệu FISH. Quang sai màu (chromatic aberration) giữa nhiều bước sóng là một vấn đề đáng kể. Đặc biệt đối với phân tích FISH đa màu, tất cả các thấu kính đều phải được hiệu chỉnh quang sai màu. Ngoài ra, nguồn sáng huỳnh quang cũng khó căn chỉnh để tạo ra ánh sáng chiếu đồng đều trên toàn bộ mẫu.
Việc phân tích các ảnh FISH đa màu đòi hỏi phải tách riêng các kênh màu khác nhau, bằng một trong hai cách: (a) sử dụng các khối lọc huỳnh quang riêng biệt cho từng loại kênh màu; hoặc (b) sử dụng mâm xoay tấm lọc kích thích (excitation filter wheel) kết hợp với gương phân cực đa dải (multipass dichroic) và tấm lọc phát xạ đa dải (multipass barrier filters). Những phát triển gần đây trong công nghệ khối lọc đã khắc phục các vấn đề trước đây do sự lệch quang học gây ra bởi việc chuyển đổi cơ học giữa các khối lọc riêng lẻ. Mâm xoay tấm lọc kích thích khi được sử dụng cùng với gương phân cực đa dải và tấm lọc phát xạ đa dải có thể hoạt động hiệu quả với tối đa ba màu bằng cách sử dụng một tấm lọc kích thích riêng cho từng màu mà không gây ra sự dịch chuyển vị trí giữa các ảnh (registration shift).
Camera CCD thường được sử dụng để thu nhận dữ liệu, nhưng gặp vấn đề về việc tái hiện màu sắc một cách chính xác. Ngoài ra, việc chồng ghép các kênh màu khác nhau được thu nhận từ các probe khác nhau trên cùng một mẫu cũng còn gặp nhiều hạn chế.
Phần mềm chụp ảnh có khả năng phân tích định lượng mẫu nhuộm huỳnh quang cũng còn hạn chế, vì các hệ thống phân tích hình ảnh trước kia chưa được tối ưu để làm việc với các mẫu huỳnh quang. Phân tích thông qua quan sát bằng mắt lại tốn nhiều công sức và thường mang tính chủ quan, và trong một số trường hợp, việc phân tích các mẫu huỳnh quang rất khó thực hiện và cho kết quả không rõ ràng nếu không có các phần mềm chụp ảnh huỳnh quang chuyên dụng. May mắn là ngày nay đã có nhiều lựa chọn phần mềm từ các nhà sản xuất, trong đó có phần mềm kính hiển vi NIS-Elements của Nikon.
Hình 2: Phần mềm NIS-Elements của Nikon với các gói khác nhau hỗ trợ cho các tác vụ chụp ảnh và nghiên cứu kính hiển vi từ cơ bản đến chuyên sâu
Bản thân các thuốc thử và probe cũng chưa đáp ứng được tất cả các ứng dụng. Ví dụ, hiệu quả phát hiện vị trí lai giảm khi kích thước của probe giảm, gây ra những hạn chế đáng kể khi quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Số lượng màu nhuộm huỳnh quang khác nhau còn hạn chế, và độ bền quang (photostability) của các thuốc nhuộm cũng kém. Tuy nhiên, những phát triển mới trong công nghệ thuốc nhuộm huỳnh quang và các công nghệ phát sinh từ dự án Human Genome Project do chính phủ liên bang Hoa Kỳ tài trợ hiện đang tạo ra những ảnh hưởng đáng kể. Hiện nay đã có các probe dành cho tất cả các nhiễm sắc thể ở người, đồng thời ngày càng có nhiều probe mới đặc hiệu cho từng gen được phát triển và cung cấp. Các bộ kit lai tại chỗ (in situ hybridization) và các probe được đánh dấu bằng chất huỳnh quang hiện đã có sẵn trên thị trường từ một số công ty.
Chi phí cũng là một trở ngại lớn khác. Trước đây vì chưa có hệ thống FISH thương mại nào được bán trên thị trường, các nhà nghiên cứu phải tự lắp đặt và xây dựng hệ thống, bao gồm thuốc thử, probe, kính hiển vi, phần cứng, phần mềm, cũng như khả năng phân tích và báo cáo dữ liệu. Để thực hiện FISH đa màu đồng thời kết hợp với phân tích hình ảnh phức tạp, chi phí có thể lên tới hơn 200.000 USD, một khoản tiền không dễ tiếp cận đối với phần lớn các nhà nghiên cứu. Do đó, nhiều nhà khoa học muốn sử dụng FISH trong phòng thí nghiệm của mình đã không thể triển khai kỹ thuật này do những hạn chế về chi phí.
FISH đã trở nên phổ biến rộng rãi
Nhiều nhà sản xuất phần cứng và phần mềm đã phát triển các giải pháp để tạo ra những hệ thống thương mại có chi phí hợp lý, thay thế cho các hệ thống được thiết kế và lắp đặt riêng trước đây. Một tinh thần hợp tác đã hình thành giữa nhiều công ty và phòng thí nghiệm tham gia vào lĩnh vực FISH, tạo điều kiện cho những bước đột phá mới được phát triển.
Một hệ thống đang được sử dụng tại Hoa Kỳ cung cấp một hệ thống FISH thương mại với mức giá tầm trung dành cho nghiên cứu, bao gồm các thành phần từ nhiều nhà sản xuất khác nhau và sử dụng những phát triển mới trong phần mềm phân tích hình ảnh, phần cứng kính hiển vi và các phụ kiện. Các phòng thí nghiệm nghiên cứu lâm sàng có thể sử dụng hệ thống này cho nhiều ứng dụng khác nhau. Hệ thống cung cấp khả năng tích hợp và tự động hóa, giúp hệ thống có thể đáp ứng khối lượng xét nghiệm lâm sàng lớn sau này.
Tính đến thời điểm hiện tại, cùng với sự phát triển không ngừng của phần cứng và phần mềm, kỹ thuật FISH dần trở nên phổ biến và dễ tiếp cận hơn bao giờ hết. Hệ thống được mình họa dưới đây là phần mềm MultiFluor (TM), đây là một trong nhưng phần mềm phân tích FISH hoàn thiện toàn diện đầu tiên trên thị trường, có khả năng phát hiện, phân tích và hiển thị các đặc điểm về cấu trúc và phân tử của các mẫu FISH đa màu. Thời gian và độ chính xác của quá trình phân tích được cải thiện bằng cách kết hợp và đối chiếu nhiều đặc điểm được đo ở các bước sóng khác nhau trong cùng một mẫu. Hệ thống hỗ trợ thu nhận hình ảnh, lưu trữ hình ảnh, quản lý cơ sở dữ liệu, điều khiển tự động kính hiển vi, cũng như phân tích dữ liệu bằng đồ họa với đầy đủ các chức năng.
Hình 3 minh họa dữ liệu hiển thị của phần mềm MultiFluor. Người dùng có thể xem hình ảnh và dữ liệu tương ứng cùng lúc, đồng thời đối chiếu các dữ liệu đa thông số từ nhiều màu sắc (bước sóng) khác nhau bằng nhiều công cụ vẽ đồ thị tương tác, bao gồm biểu đồ histogram, biểu đồ phân tán (scattergram),…
Hình 3: hiển thị dữ liệu phần mềm MultiFluor
Các nhà nghiên cứu FISH có thể tự động chụp ảnh ở nhiều bước sóng và nhiều mặt phẳng lấy nét, hiển thị các probe FISH đa màu, chú thích và in hình ảnh, đồng thời lưu trữ và truy xuất một lượng lớn dữ liệu hình ảnh đa màu. Các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa trong FISH đa màu có thể được phân tích, bao gồm lập bản đồ gen, tính toán tỷ lệ CGH (comparative genomic hybridization) và tạo bộ nhiễm sắc thể (karyotype). Người dùng có thể chọn các vùng cụ thể trên mẫu để quét và phân tích. Phần mềm sẽ tự động lấy nét, thu nhận hình ảnh ở nhiều bước sóng, ghi lại vị trí của các tế bào trên lam kính, đồng thời đo nhiều đặc điểm, bao gồm số lượng probe, cường độ huỳnh quang và hình thái tế bào. Các đặc điểm khác nhau được thu nhận ở nhiều bước sóng có thể được đối chiếu và phân tích mối tương quan với nhau.
Phần mềm cho phép tất cả các thành phần của hình ảnh được hiển thị bằng màu (pseudocolor) rõ nét khi chụp ảnh đa màu đồng thời. Ví dụ, hình ảnh của một thí nghiệm đồng thời bốn màu sử dụng DAPI (màu xanh dương), FITC (màu xanh lá), CY3 (màu đỏ) và sự kết hợp FITC-CY3 (màu vàng) có thể được hiển thị riêng lẻ, hoặc kết hợp với nhau để tạo thành hình ảnh tổng hợp màu như trong hình 1. Mỗi hình ảnh có thể được điều chỉnh và tăng cường tín hiệu trực tiếp để làm rõ những đặc điểm quan tâm. Ngoài ra, phần mềm có thể dễ dàng tạo histogram, scattergram, bảng tính, biểu đồ đường và các dạng bảng biểu hoặc công cụ khác để trình bày và xem xét dữ liệu (Hình 3). Cuối cùng, dữ liệu được lưu trữ dưới định dạng cơ sở dữ liệu phổ biến và dễ truy cập, đồng thời có thể được lưu dưới dạng các tệp TIFF, JPEG, GIF hoặc các định dạng tệp khác.
Hệ thống quang học truyền sáng
Phần cứng của kính hiển vi tự động cũng là một phần quan trọng của hệ thống. Các hệ thống kính hiển vi Nikon và các model được phát triển sau đó (Nikon Instruments Inc.,) được trang bị bàn sa và hệ thống lấy nét tự động điều khiển bằng máy tính, có khả năng lưu tọa độ của từng đối tượng. Nhờ đó, các vị trí quan trọng trên tế bào và nhiễm sắc thể có thể được tìm lại ngay lập tức trên lam kính chỉ bằng cách nhấp chuột. Điều này cho phép người dùng quan sát hoặc kiểm tra mẫu kỹ hơn trên kính hiển vi.
Hình 4: hệ kính hiển vi soi thẳng huỳnh quang tự độ hóa của hãng Nikon, phù hợp với các kỹ thuật ứng dụng FISH. Model: Eclipse Ci & Eclipse Ni
Bên cạnh đó, một trong những ưu điểm quan trọng nhất của hệ thống kính hiển vi là sự phát triển của một hệ thống chiếu sáng được thiết kế dành riêng cho các ứng dụng FISH. Các hệ chiếu sáng huỳnh quang phản xạ (epi-fluorescence illuminator) và các model được phát triển sau đó (Nikon Instruments Inc.) có thể lắp tối đa sáu khối lọc huỳnh quang, giúp tăng đáng kể độ sáng và độ tương phản của hình ảnh. Đây là những ưu điểm rất quan trọng đối với các nhà nghiên cứu làm việc với nhiều loại thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau.
Hình 5: Hệ kính hiển vi huỳnh quang (bên phải) cùng với mâm xoay có thể lắp tối đa 6 khối lọc (trên trái) và hệ đèn LED huỳnh quang (dưới trái) của hãng Nikon, phù hợp với các kỹ thuật ứng dụng FISH.
Với bộ chiếu sáng này, các nhà nghiên cứu thực hiện FISH và các kỹ thuật huỳnh quang nâng cao khác có thể làm việc với bốn hoặc nhiều probe khác nhau mà không cần dừng lại để thay khối lọc. Độ chính xác cao trong việc giữ cho hình ảnh của các kênh màu trùng khớp vị trí nhờ cơ chế chuyển động nhẹ nhàng của một thanh trượt tuyến tính có độ chính xác cao, được sử dụng để chuyển đổi giữa các khối lọc.
Các khối lọc giúp tăng độ sáng và tạo ra độ tương phản rất cao nhờ sử dụng công nghệ kết hợp giữa ba tấm lọc: tấm lọc kích thích, tấm lọc lưỡng sắc và tấm lọc phát xạ; hệ thống chắn sáng bên trong; cùng với các lớp phủ chống phản xạ độc quyền. Ngoài ra, hệ chiếu sáng huỳnh quang phản xạ có thể chứa tối đa sáu khối lọc cùng lúc để tách các tín hiệu huỳnh quang khác nhau, giúp tối đa hóa khả năng chụp các kênh màu khác nhau.
Các vật kính có độ truyền sáng cao cũng rất cần thiết để chụp ảnh các vùng quan tâm rất nhỏ trên nhiễm sắc thể. Các vật kính CFI60 Plan Fluor (Nikon Instruments Inc.) sử dụng keo quang học và lớp phủ có độ truyền sáng cao, cho phép truyền qua dải bước sóng rộng hơn và tạo ra hình ảnh sáng hơn. Các vật kính này loại bỏ những hiện tượng về quang sai sắc và quang sai cầu, đồng thời cho độ tương phản rất cao và mức tự phát huỳnh quang nền thấp.
Hình 6: Minh họa một vài dòng vật kính của hãng Nikon, với khả năng loại bỏ quang sai cầu và quang sai sắc, phù hợp với các kỹ thuật ứng dụng FISH
Camera cũng là một thành phần quan trọng trong các hệ thống này. Hình ảnh có thể được thu nhận bằng camera CMOS kỹ thuật số. Đặc biệt đối với các ứng dụng chụp ảnh huỳnh quang như FISH, camera CMOS có hiệu suất lượng tử cao, độ nhiễu đọc thấp và tốc độ thu nhận hình ảnh nhanh, cho phép phát hiện các tín hiệu huỳnh quang yếu từ những vùng rất nhỏ của đầu dò trên nhiễm sắc thể mà vẫn duy trì độ trung thực của hình ảnh. Các cảm biến CMOS có độ phân giải cao cũng giúp phân biệt các tín hiệu huỳnh quang nằm gần nhau trên từng nhiễm sắc thể. Với phần mềm chụp ảnh phù hợp, các thiết lập như thời gian phơi sáng, độ khuếch đại (gain) và các thông số thu nhận khác của camera có thể được tự động tối ưu hóa cùng với kính hiển vi hoàn toàn tự động. Điều này giúp quá trình thu nhận hình ảnh FISH có độ ổn định và độ chính xác cao hơn, đồng thời đơn giản hóa việc sử dụng hệ thống.
Hình 7: Các dòng camera CMOS dùng trong nghiên cứu khoa học kính hiển vi của hãng Nikon, với độ phân giải và hiệu suất lượng tử cao, phù hợp trong các nghiên cứu ứng dụng huỳnh quang và FISH.
Nghiên cứu ung thư, tiền sản, sinh học
Các hệ thống FISH hiện nay đã hoàn thiện và được thiết kế để có thể tiếp cận với nhiều nhà nghiên cứu hơn so với các hệ thống tùy chỉnh trước đây, và đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu ung thư, mô bệnh học, di truyền tế bào học và sinh học. Các ứng dụng này bao gồm phân tích tế bào ở kỳ trung gian để đếm tín hiệu các điểm huỳnh quang, phân tích miễn dịch (immunophenotyping), phân tích hình thái tế bào và xác định hàm lượng DNA.
Không những thế, hệ thống này hiện đang được sử dụng để kiểm tra các bất thường về số lượng bản sao của nhiễm sắc thể, kết hợp với việc xác định tổng hàm lượng DNA, có liên quan đến các khối u bàng quang. Trong nghiên cứu trước sinh (prenatal), hệ thống có thể được sử dụng để kiểm tra tình trạng lệch bội trong nhân của các tế bào ở kỳ trung gian, có liên quan đến các bất thường trước sinh, như hội chứng Down, hội chứng Turner, hội chứng Klinefelter và các hội chứng khác.
Trong nghiên cứu sinh học tế bào và sinh học phát triển, hệ thống có thể được sử dụng để lập bản đồ sự hiện diện và sự phân bố tương đối của các marker trên bề mặt tế bào như các thụ thể, các marker trong tế bào chất bao gồm các protein thuộc khung xương tế bào, mRNA và các gen đặc hiệu.
Tiềm năng trong chẩn đoán lâm sàng
Kỹ thuật FISH có tiềm năng rất lớn, không chỉ như một công cụ phục vụ nghiên cứu cơ bản mà còn trong chẩn đoán lâm sàng, chẳng hạn như chẩn đoán trước sinh, di truyền tế bào học và đánh giá khối u.
Sự xuất hiện của các hệ thống FISH thương mại có hiệu năng cao nhưng chi phí hợp lý hơn đã giúp giải quyết phần nào vấn đề này. Những hệ thống này có thể thực hiện các phân tích phức tạp mà trước đây cần đến các hệ thống tùy chỉnh đắt tiền. Nhờ đó, FISH có nhiều cơ hội được ứng dụng rộng rãi hơn, không chỉ trong các nghiên cứu y sinh mà còn trong xét nghiệm và chẩn đoán bệnh cho bệnh nhân. Đây là bước chuyển quan trọng, đưa FISH từ một kỹ thuật chủ yếu phục vụ nghiên cứu chuyên sâu đến gần hơn với các ứng dụng thực tế trong y tế.
Tham khảo: https://www.microscopyu.com/applications/fluorescence-in-situ-hybridization-fish/fluorescence-in-situ-hybridization
Đại lý chính hãng Kính hiển vi Sinh học NIKON Nhật Bản – NIVINA.,Co
Liên hệ ngay với chúng tôi – Công ty TNHH NI VINA – để sở hữu các thiết bị của hãng NIKON từ dòng kính Sinh Học đến Dòng Kính hiển vi Công nghiệp
– Hotline: 086-986-5068
– Zalo OA: NI VINA Company (https://zalo.me/nivina)
– Email: marketing@nivina.com.vn
– Địa chỉ:Trụ Sở – Hà Nội: Ô DV3-2.10, Tầng 2, Tòa nhà CT2&3, KĐT Dream Town, đường 70, Tây Mỗ, Nam Từ Liêm, Hà Nội
– Chi Nhánh Hồ Chí Minh: Tầng 3, Số 77 Tân Kỳ Tân Quý, Phường Tân Sơn Nhì, Quận Tân Phú, TP. HCM
Tham khảo: https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/depth-of-field-and-depth-of-focus
Tìm đọc thêm: Extended Depth of Field (EDF), incoherent illumination
